Materiały polimerowe w medycynie: proces weryfikacji

Badania in vitro

Biomateriały, których przeznaczeniem jest kontakt z żywym organizmem, a w szczególności organizmem ludzkim, muszą wykazywać odpowiednie właściwości biologiczne. Ważne jest, aby materiał spełniał nie tylko wymogi fizykochemiczne i mechaniczne, ale również należy poddać go badaniom biologicznym w warunkach in vitro i in vivo. Dopiero po uzyskaniu prawidłowych wyników, możliwe jest przeprowadzenie badań przedklinicznych i klinicznych. 

Planowanie i rodzaje badań

Przed zaplanowaniem badań biologicznych istotnym elementem jest przeanalizowanie dostępnej na rynku literatury oraz wyników badań. Pozwoli to na upewnienie się czy wyrób, który ma być badany, jest całkowitą nowością na rynku. Często zdarza się, że produkt ma już częściowo udokumentowane wyniki badań, w związku z czym nie ma konieczności dublowania ich. Decyzja o podjęciu badań pociąga za sobą konieczność przeanalizowania, w jaki sposób wyrób będzie się kontaktował z organizmem człowieka i jak długo ten kontakt będzie trwał. Kolejną ważną rzeczą jest przeanalizowanie cech własnych implantu, co dostarczy informacji o tym, czy jest konieczne wykonanie badań dodatkowych, ponad obowiązkowe. Prawidłowa, a zarazem kompletna ocena wyrobów implantacyjnych, wymaga doboru takich badań, które są związane z ich charakterystyką i zastosowaniem. W związku z tym charakterystyka materiałów powinna uwzględniać:

• sposób wytwarzania materiału
• zastosowane dodatki oraz zanieczyszczenia powstające w procesie wytwarzania
• wymywalne związki chemiczne
• pozostałe komponenty oraz ich możliwe interakcje w gotowym produkcie
• właściwości gotowego wyrobu.

Badania, jakie powinny zostać wzięte pod uwagę dla wszystkich kategorii wyrobów oraz czasu pozostawania w kontakcie z organizmem ludzkim, przedstawione zostały w normie ISO 10993-1. Najważniejsze zalecenia zebrano w tabeli. Można zauważyć, że największe wymagania pod kątem kierunku badań biologicznych cechują wyroby, które są wprowadzane do organizmu na okres powyżej 30 dni.

Pierwszym etapem oceny nowych wyrobów medycznych jest przygotowanie prób kontrolnych i materiałów referencyjnych. Najpierw należy ustalić wzorce pozytywne (materiały wykazujące odpowiednią reakcję pozytywną w danym układzie badawczym) i negatywne (materiały niewykazujące aktywności). W zależności od badania używa się również próby ślepej, w której układ badawczy nie ma kontaktu z materiałem. Zgodnie z normą ISO 10993-8 wykorzystuje się różne materiały kontrolne dopasowane do procedury badawczej. Przykładowo, do badań implantacyjnych stosowany jest polietylen o niskiej i wysokiej gęstości oraz poli(dimetylosiloksan), który nie zawiera krzemionki - jako materiały kontrolne negatywne, a jako pozytywny - poli(chlorek winylu), który jest plastyfikowany bądź zawiera dodatki cynoorganiczne. Inny rodzaj badań wykorzystuje ekstrakty, które dostarczają informacji o chociażby reaktywności biologicznej związków.

Badania degradacji materiałów

Bez względu na czas trwania i rodzaj kontaktu, każdy materiał przechodzi podstawowe badania związane z jego odpornością i trwałością w warunkach, które są jak najbardziej zbliżone do tych występujących w organizmie człowieka. Zarówno metody badań, jak i podstawowe pojęcia zdefiniowane są w normie ISO 10993 arkusz 9 - Degradacja materiałów związanych z badaniami biologicznymi. Zgodnie z tą normą, badania degradacji należy przeprowadzić w przypadku, kiedy:

• materiał pozostaje w organizmie powyżej 30 dni 
• występuje uzasadnione podejrzenie uwalniania się substancji toksycznych do organizmu w warunkach pracy in vitro bądź in vivo
• w momencie, gdy badany wyrób medyczny jest bioresorbowalny.

Oprócz określenia przypadków, w których należy przeprowadzić badania, w normie znajdują się także informacje dotyczące możliwości rezygnacji z ich wykonywania. Są one przede wszystkim związane z istniejącymi już wynikami analiz, dotyczącymi badanego materiału. Tylko po przeprowadzeniu badań degradacji w warunkach in vitro, możliwe jest przejście do kolejnego etapu, jakim są badania in vivo.

Przeprowadzając badania związane z degradacją tworzywa należy pamiętać, że ocenie poddawany jest zarówno sam materiał, jak i środowisko, w którym przebywał. Oznaczania produktów degradacji dokonuje się z wykorzystaniem metod z zakresu chemii analitycznej oraz inżynierii materiałowej. W momencie stwierdzenia zmian w materiale po badaniach degradacji należy ocenić go pod kątem zmian morfologii powierzchni, zmian biochemicznych oraz właściwości chemicznych i fizykochemicznych. 

Ważne jest, aby w raporcie końcowym opisać zastosowaną metodę, jak i wszelkie normy, z których korzystano. Ponadto, protokół powinien zawierać informacje dotyczące identyfikacji i charakterystyki badanego materiału oraz mechanizmu i produktów jego degradacji. 

W zależności od rodzaju tworzywa stosuje się konkretne normy: dla materiałów metalowych - ISO 10993-15, ceramicznych - ISO 10993-14 i polimerowych - ISO 10993-13. Dodatkowo korzysta się jeszcze z norm powiązanych z konkretną grupą użytkową - np. dla implantów okulistycznych jest to norma ISO 11979-6:2014. 

Degradacja polimerów 

Materiały polimerowe są obecnie wykorzystywane w przemyśle farmaceutycznym, budowlanym, samochodowym, papierniczym czy spożywczym, dlatego tak istotne jest określenie sposobu ich degradacji oraz oznaczenie jakościowe i ilościowe powstałych produktów. W przypadku materiałów polimerowych przeznaczonych do implantacji, norma podaje dwie metody badań - degradację w czasie rzeczywistym oraz w czasie przyspieszonym. Degradacja w czasie przyspieszonym - metoda skriningowa -wykorzystywana jest jako metoda przesiewowa, a degradacja w czasie rzeczywistym przeprowadzana jest w środowisku symulowanym. Proces degradacji może zachodzić pod wpływem wielu czynników, takich jak promieniowanie jonizujące, ultradźwięki, powietrze, enzymy czy bakterie. Wynikiem zaś jest utrata masy molowej, tworzenie się bądź sieciowanie nowych struktur, jak również utworzenie wolnych makrorodników. Zaleceń normy nie stosuje się jednak dla polimerów, które rozpadają się pod wpływem przyłożonego obciążenia bądź promieniowania elektromagnetycznego. 

Degradację w czasie rzeczywistym należy prowadzić w temperaturze 37 ± 1°C. Monitoring jej stopnia przeprowadza się po 1, 3, 6 i 12 miesiącach dla wyrobów, które mają pozostawać w organizmie powyżej 30 dni. Dla wyrobów pozostających w organizmie do tego czasu lub krócej, wymagana jest ocena czterokrotna. Osobnym przypadkiem są polimery resorbowalne, dla których kontrolę prowadzi się do momentu utraty spójności materiału.

Degradację w czasie przyspieszonym przeprowadza się w temperaturze wyższej niż 37°C, ale poniżej poziomu rozpuszczania bądź topienia się materiału, dlatego też temperatura ta jest ściśle powiązana z rodzajem badanego polimeru i wynosi średnio około 70 ± 2°C. Dla materiałów bądź wyrobów, które pozostawać mają w organizmie ludzkim powyżej 30 dni, kontrolę stopnia degradacji należy przeprowadzić po 2 i 60 dniach, a dla wyrobów, które pozostawać mają krócej - po 2 i 7 dniach. Przedstawione zakresy mają charakter informacyjny; właściwy czas ustalany jest w zależności od rodzaju materiału lub planowanego zużycia wyrobu.

W normie zawarto również informację o rodzaju medium, które zależy głównie od mechanizmu degradacji oraz minimalnej liczby próbek i materiałów odniesienia. Końcowy raport zawiera informację o ewentualnym ubytku masy oraz zmianach w masie cząsteczkowej. Wykonanie badań w środowisku symulowanym jest zależne od tego, czy wykryte zostaną zmiany w badaniu w czasie przyspieszonym. 

Norma PN - EN ISO 10993-13 jest normą podstawową. Jej uzupełnienie stanowią normy szczegółowe, w których przedstawiono bardziej precyzyjne badania powiązane z konkretnym implantem bądź wyrobem medycznym. Istotny jest zatem dokładny przegląd literaturowy, ponieważ to właśnie dzięki niemu określa się, jakie normy i badania związane z degradacją powinny zostać wykonane, przez co możliwe będzie rozpoczęcie badań w środowisku in vivo. 

Badania cytotoksyczności 

Kolejnym niezwykle ważnym etapem są badania związane z cytotoksycznym działaniem materiału na komórki biorcy. W tym celu wykorzystywane są odpowiednie linie komórkowe, których główne zalety to stabilność i homogenność. W zależności od wyrobu medycznego bądź przeznaczenia implantu wybierane są konkretne linie komórkowe, takie jak chondrocyty, osteoblasty czy fibroblasty, dzięki czemu badania są niezwykle precyzyjne. Co prawda, badania cytotoksyczności in vitro nie oddają w pełni działania toksycznego in vivo, jednak mogą być doskonałą wskazówką dotyczącą mechanizmu oddziaływania na komórkę. Podstawową normą, która określa warunki i sposób prowadzenia badań jest norma PN-EN ISO 10993-5:2009, Biologiczna ocena wyrobów medycznych - Część 5: Badania cytotoksyczności in vitro. Przewiduje ona trzy testy dla oceny wyrobów medycznych, w zależności od rodzaju materiału i jego przeznaczenia. Są to odpowiednio: testy oparte o bezpośredni kontakt, test dyfuzji w agarze oraz test na wyciągach. W normie określone zostały również warunki przygotowania hodowli do poszczególnych testów, zalecane linie komórkowe, niezbędne ilości próby badanej i kontrolnej oraz warunki ich przygotowania, warunki ekstrakcji, rodzaj materiału, który należy zastosować jako kontrolę pozytywną i negatywną oraz kryteria oceny uzyskanych wyników. Opisane procedury pozwalają na dokonanie jakościowej i ilościowej oceny toksyczności. Przykładowo dla testu na wyciągach ocenia się zmiany morfologiczne komórek wywołane przez substancje wyekstrahowane z badanego materiału w odniesieniu do pięciostopniowej skali: 

• stopień 0 - wyrób nietoksyczny (możliwe jest występowanie pojedynczych ziarnistości wewnątrzplazmatycznych)
• stopień I - wyrób słabo toksyczny (pojedyncze komórki rozerwane, około 20% komórek zaokrąglonych, odklejających się)
• stopień II - wyrób umiarkowanie toksyczny (umiarkowana liza komórek, zahamowanie proliferacji w około 50%, około 50% komórek zaokrąglonych)
• stopień III - wyrób średnio toksyczny (zahamowanie proliferacji, zaawansowana liza komórek, około 70% komórek zaokrąglonych, odklejających się)
• stopień IV - wyrób silnie toksyczny (hodowla prawie całkowicie zniszczona).

Podobnie wygląda ocena jakościowa dla testu dyfuzji w agarze i testu bezpośredniego kontaktu. Do oceny ilościowej zalecane jest wykonanie testu z czerwienią obojętną lub jego odmian, bądź testu tworzenia kolonii.

Testy cytotoksyczności przeprowadza się najczęściej z wykorzystaniem płytek 24- lub 96-dołkowych. Komórki są hodowane wraz z badanym materiałem od kilkunastu godzin do kilku dni, a następnie przeprowadza się właściwą ocenę. Pierwszym etapem jest określenie żywotności komórek i typów śmierci komórkowej. Żywotność komórek jest określana za pomocą testów kolorymetrycznych (przykładowo AlamarBlue), testu pinocytozy czerwieni obojętnej (NR) bądź testów, które wykorzystują barwniki fluorescencyjne jak i przeciwciała sprzężone z fluorochromami. Apoptozę komórek można oceniać ilościowo, wykorzystując barwnik PI - jodek propidyny lub 7-AAD w połączeniu z aneksyną V. 

Aneksyna V (AnV) jest białkiem o masie cząsteczkowej 32-35 kDa, biorącym udział w przekazywaniu sygnałów i proliferacji komórki, homeostazie wapnia, regulacji transportu pęcherzykowego, jak i w oddziaływaniu z błoną komórkową. Ponadto charakteryzują ją silne właściwości antykoagulacyjne. Jej obecność wykazano w wielu komórkach organizmu - przykładowo w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich naczyń krwionośnych, w limfocytach, makrofagach, na powierzchni erytrocytów czy płytkach krwi. Występuje ona także w komórkach kanalików dystalnych i nabłonku kłębuszków nerkowych. Aneksyna V wykazuje wysokie powinowactwo do fosfatydyloseryny, która pojawia się na zewnętrznej stronie błony komórkowej w trakcie apoptozy. 

Najczęściej stosowanym testem oznaczania aktywności cytotoskycznej w warunkach in vitro jest jednak test MTT, oparty na zdolności dehydrogenazy mitochondrialnej (enzymu) do przekształcenia soli tetrazolowej do nierozpuszczalnego formazanu. Kryształy formazanu rozpuszcza się w izopropanolu lub w DMSO, a następnie bada się intensywność zabarwienia w zakresie długości fal 492-570 nm. Jego ilość jest proporcjonalna do aktywności oksydacyjnej mitochondriów komórki, a w ściśle sprecyzowanych warunkach doświadczalnych do liczby żywych komórek w populacji. 

Zarówno żywotność, jak i apoptozę można badać również z wykorzystaniem testu luminescencyjnego ViaLight. Test ten polega na bioluminescencyjnym wykrywaniu komórkowego ATP, która stanowi miarę żywotności. Pomiar ATP jest najdokładniejszym, najbardziej skutecznym i bezpośrednim sposobem określania liczby żywych komórek w kulturze. Test można przeprowadzić na różnych luminometrach. Innym sposobem jest wykonanie testu z użyciem odczynnika AlamarBlue, który zawiera przepuszczalny dla komórek, nietoksyczny i słabo fluorescencyjny niebieski barwnik wskazujący resazurynę. W teście następuje ilościowy pomiar proliferacji w komórkach ludzkich, zwierzęcych, bakteryjnych, grzybowych i mykobakteryjnych. Jest użyteczny nie tylko w testach żywotności komórek i oznaczeniach cytotoksyczności in vitro, ale również w testach biologicznych cytokin czy w monitorowaniu wzrostu komórek. 

Kolejnym krokiem jest ocena morfologii komórek, której można dokonać z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej, skaningowej, jak i transmisyjnej. Wykorzystuje się również mikroskopię elektronową. W następnych etapach należy oszacować zdolność komórek do przylegania do badanego biomateriału oraz zbadać ich zdolności do proliferacji i aktywności enzymatycznej. Dopiero po przeprowadzeniu tych procedur możliwe jest sformułowanie odpowiedzi, w jakim stopniu badany materiał bądź wyrób medyczny jest toksyczny dla organizmu. Pozytywne wyniki testów umożliwią również podjęcie badań in vivo.

Badania genotoksyczności i rakotwórczości biomateriałów 

Współczesne badania rakotwórczości związków chemicznych zazwyczaj opierają się na badaniach epidemiologicznych, które charakteryzują się długim czasem trwania i wysoką ceną. Alternatywę dla nich mogą stanowić testy biologiczne. Badania rakotwórczości przeprowadzane na zwierzętach również są drogie, dyskusyjne pod względem etycznym, ale zajmują zdecydowanie mniej czasu niż badania epidemiologiczne. 

W ostatnich latach do przewidywania działania kancerogennego i mutagennego związków chemicznych zaczęto wykorzystywać szybkie testy biologiczne oparte na drobnoustrojach. Zazwyczaj są one stosowane jako testy wstępne. Zgodnie z wytycznymi Organizacji Współpracy Ekonomicznej i Rozwoju (OECD) testy powinny być przeprowadzane dla substancji rozpuszczalnych. W przypadku substancji nierozpuszczalnych powinny zostać przeprowadzone modyfikacje tych metod. Pomimo wielu minusów, metody badania rakotwórczości i genotoksyczności powinny zostać przeprowadzone w przypadku biomateriałów, które mają mieć potencjalne zastosowanie w medycynie regeneracyjnej. Najczęściej należy wykonać kilka testów, ze względu na to że żaden z nich nie jest w stanie wykryć wszystkich typów genotoksyczności.

Jedną z zalecanych metod badania genotoksyczności jest test Amesa, który zgodnie z wytycznymi OECD TG 471, przeprowadzany jest na histydyno-zależnych mutantach Salmonella typhimurium i opiera się na badaniu mutacji powrotnych. Działanie czynnika mutagennego na bakterie może powodować rewersję mutacji, dającą w efekcie przywrócenie funkcjonalnego genu. Formy prototroficzne są zdolne do wzrostu na podłożu niezawierającym histydyny. Do oceny mutagenności mogą być również wykorzystywane szczepy E. coli lacZ-, które syntetyzują nieaktywną formę beta-galoktozydazy. 

Inną metodą badania genotoksyczności jest test mutacji genu kinazy tymidynowej na komórkach chłoniaka myszy, który pozwala na ocenę genotoksyczności wielu substancji chemicznych. Mysie komórki nowotworowe są hodowane w środowisku zawierającym czynnik toksyczny. Obecność kinazy tymidynowej pozwala na wbudowywanie tymidyny lub jej analogów do materiału genetycznego. Dodanie do pożywki hodowlanej trójfluorotymidyny (TFT) pozwala wyselekcjonować mutanty komórek, które nabywają zdolności namnażania się w obecności TFT. 

Zgodnie z wytycznymi OECD i normy PN-EN ISO 10993-3:2014-12, w celu badania genotoksyczności należy przeprowadzić analizę mikrojąder, które stanowią fragmenty chromosomów. Obecność mikrojąder świadczy o nieprawidłowościach podczas podziału komórkowego. W praktyce test przeprowadza się na liniach komórkowych jajnika chomika chińskiego CHO-K1. Analiza cytogenetyczna komórek poddanych działaniu substancji mutagennych pozwala określić stopień uszkodzeń materiału genetycznego.