Znormalizowane metody oznaczania właściwości biobójczych materiałów polimerowych

Normy badawcze ISO umożliwiają powtarzalne i odtwarzalne badania biologiczne, w tym biobójcze (bakteriobójcze i grzybobójcze) materiałów polimerowych. Procedury zawarte w normach ISO (International Organization for Standardization) dotyczą określania właściwości bakteriobójczych (norma ISO 22196) oraz grzybobójczych (norma ISO 846) materiału polimerowego. Każda z norm proponuje inne podejście do problemu badawczego i zaleca różne możliwości przeanalizowania danego przypadku. Co tak naprawdę je różni? Norma ISO 22196 ma charakter ilościowy, z kolei norma ISO 846 - jakościowy. Zarówno pierwsza, jak i druga są rekomendowane przez Międzynarodową Organizację Normalizacyjną (ISO).

Wstęp

Materiały polimerowe są obecnie powszechnie wytwarzane, modyfikowane i stosowane. Spotyka się je niemal w każdej dziedzinie gospodarki i codziennego życia. Dyscyplina, która aktualnie rozwija się najszybciej, dotyczy właśnie produkcji przedmiotów codziennego użytku. Z tym jest ściśle związany rozwój nowych technologii oraz innowacyjnych materiałów. Bardzo często wynalazcze materiały dotyczą tworzyw modyfikowanych substancjami biobójczymi, dlatego należy je badać nie tylko pod kątem właściwości fizykochemicznych, ale także parametrów biologicznych.

Warto zastanowić się, dlaczego badania biologiczne (a konkretnie: biobójcze) materiałów polimerowych są ważne.

Na każdym rodzaju powierzchni, w tym na opakowaniach i foliach, mogą osiadać, osadzać się i namnażać drobnoustroje. Mikroorganizmy przylegają bardzo silnie do powierzchni i wytwarzają warstwy, nazywane błonami biologicznymi lub biofilmami. Dlaczego mikroby tak robią? Pozwala im to na łatwiejszy dostęp do składników odżywczych, a także chroni komórki przed negatywnym wpływem czynników środowiskowych. Zdolności adhezyjne mikroorganizmów mają ogromny wpływ na zdolność do wywoływania groźnych zakażeń i obszernych zanieczyszczeń. Komórki bakteryjne przylegają do siebie nawzajem oraz do powierzchni stałych, wykazują też odporność na znaczną część środków przeciwbakteryjnych i są około 1000 razy bardziej odporne na działanie tych środków niż mikroorganizmy pozostające w zwykłej zawiesinie.

Biofilm bakteryjny jest strukturą chroniącą komórki przed substancjami bakteriobójczymi. Można go ograniczyć, wprowadzając do osnowy polimerowej substancje biobójcze. Poruszając zagadnienie związane z substancjami o charakterze bakteriobójczym czy biostatycznym, należy wyjaśnić 2 pojęcia, mianowicie "aktywność antybakteryjna" i "skuteczność antybakteryjna", które nierzadko są mylnie stosowane. Aktywność antybakteryjna ma konkretną wartość liczbową. Jest to różnica w logarytmach pomiędzy żywymi komórkami bakteryjnymi zliczonymi z produktu (np. z danej folii opakowaniowej) zawierającego antybakteryjną substancję i produktu wolnego od tej substancji (kontrola). Z kolei antybakteryjna skuteczność to zdolność substancji antybakteryjnej do hamowania wzrostu bakterii na powierzchni materiału polimerowego zawierającego substancję bakteriobójczą. Zatem skuteczność antybakteryjna jest determinowana przez aktywność antybakteryjną.

Badanie materiałów polimerowych pod kątem biologicznym nie jest łatwe, ze względu na różnorodność czynników biologicznych, które dodatkowo bardzo często bywają „kapryśne”. Wyniki oznaczeń biologicznych mogą różnić się między sobą. Ma na to wpływ chociażby ilość (porcja) pobranych mikroorganizmów (tzw. inoculum mikrobiologiczne), a także warunki temperaturowe, pH, rodzaj mikroorganizmu, czy czasy trwania badania.

Najnowsze osiągnięcia naukowe opisywane w literaturze światowej jednoznacznie wskazują na rozwój biologicznych metod badawczych dotyczących materiałów polimerowych, nie stanowią one jednak konkurencji względem analiz określonych w normach międzynarodowych, które zapewniają rzetelność, jednolitość, odtwarzalność i powtarzalność wyników.

Jako pierwsza została wydana norma ISO 846, później ISO 22196. W chwili obecnej obydwie spełniają swoją rolę i mogą być stosowane równocześnie lub zamiennie, w zależności od materiału badawczego i tego, który parametr wyznaczyć: bakteriobójczość, czy grzybobójczość.

Norma ISO 846: "Tworzywa sztuczne. Ocena działania mikroorganizmów"

W normie tej zawarte są kryteria i metody prowadzące do jakościowej oceny oddziaływania mikroorganizmów na tworzywa sztuczne. Badane materiały polimerowe stanowią pożywkę dla wzrostu mikroorganizmów oraz oddziałują pośrednio, czyli mają wpływ na produkty metabolizmu mikroorganizmów, czego efektem są np. odbarwienia.

Zakres normy obejmuje metody oznaczania działania zarówno grzybów z kolekcji czystych szczepów mikroorganizmów ATTC (ang. American Type Culture Collection): Aspergillus niger (ATCC 6275), Penicillium funiculosum (ATCC 114933), Chaetomium globosum (ATCC 6205), Glioclidium virens (ATCC 9645), Paeliomyces variotii (ATCC 18502), Aspergillus pullulans (ATCC 9348), Penicillium ochrochloron (ATCC 9112), bakterii Pseudomonas aeruginosa (ATCC 13388), jak i mikroorganizmów glebowych na materiały polimerowe. Rodzaj i stopień działania określa się poprzez: zmiany wyglądu zewnętrznego, zmiany masy oraz innych właściwości fizycznych. Testy przeprowadzone zgodnie z tą normą są ważne dla wszystkich tworzyw sztucznych o płaskiej powierzchni, za wyjątkiem pianek z tworzyw sztucznych.

Czy można w takim razie zastosować w badaniu inne grzyby, niż te wskazane w normie? Odpowiedź brzmi „tak”, ponieważ można wykorzystać szczepy testowe, które zależą od przewidywanego zastosowania tworzywa sztucznego. Należy pamiętać, że w określonych warunkach - zarówno klimatycznych i środowiskowych - mikroorganizmy osadzają się na powierzchniach plastikowych i szybko się tam rozprzestrzeniają. Cała procedura opisana w normie ma charakter eksperymentalny i obejmuje praktycznie wszystkie potencjalne zastosowania.

Wpływ mikroorganizmów na tworzywa sztuczne zachodzi w wyniku działania bezpośredniego i pośredniego. Proces bezpośredni to degradacja tworzyw sztucznych, które działają jako składnik odżywczy, służący dla wzrostu mikroorganizmów, z kolei działanie pośrednie to wpływ produktów przemiany materii mikroorganizmów, który przejawia się np. odbarwieniem materiału.

W normie zaproponowane są metody testowe:

• Metoda A: Badania wzrostu grzybni (odporność na grzyby),
• Metoda B i B’: Oznaczenie efektu grzybostatycznego (odporność na grzyby),
• Metoda C: Odporność na bakterie.
  

Norma ISO 846 zapewnia uzyskanie wyników dotyczących działania biobójczego przetworzonych tworzyw sztucznych, które są uznawane na całym świecie.

Podczas analiz próbki z materiałów polimerowych umieszcza się je na szalce zawierającej pożywkę agarową i równomiernie umieszcza się na nich mikroorganizmy, takie jak Pseudomonas aeruginosa (według normy) lub inne szczepy bakterii lub grzybów (według analiz pod kątem danego materiału). Po okresie inkubacji płytki monitoruje się i bada w odniesieniu do wzrostu bakterii lub grzybów przez 4 tygodnie. W tym czasie badane mikroorganizmy wykorzystują tworzywo sztuczne jako źródło pożywienia, aby przetrwać. Testy te obejmują wystawienie tworzywa sztucznego na działanie grzybów i szczepów testowych bakterii w określonych warunkach temperaturowych przez określony czas.

Pod koniec inkubacji badane próbki są oceniane przez wizualizację przed i po czyszczeniu. Określane są wszelkie zmiany w postaci zmiany masy lub innych właściwości fizycznych.

Wzrost grzybów ocenia się według następującej skali:

• 0 - brak widocznego wzrostu pod mikroskopem,
• 1 - wzrost niewidoczny nieuzbrojonym okiem, lecz wyraźnie widoczny pod mikroskopem,
• 2 - wzrost dostrzegalny nieuzbrojonym okiem, pokrywający do 25% powierzchni badanej,
• 3 - wzrost dostrzegalny nieuzbrojonym okiem, pokrywający do 50% powierzchni badanej,
• 4 - znaczny wzrost, pokrywający więcej niż 50% powierzchni badanej,
• 5 - intensywny wzrost, pokrywający całą powierzchnię badaną.

Z kolei powyższe wartości ze skali interpretuje się w następujący sposób:

• 0 - oznacza, że materiał nie jest pożywką dla mikroorganizmów i jest inertny (bierny, niewchodzący w reakcje) lub bakteriobójczy (metoda A),
• 0 - silny efekt grzybostatyczny (metoda B i B’),
• 1 - materiał zawiera substancje stanowiące pożywkę lub jest zanieczyszczony w niewielkim stopniu, umożliwiającym nieznaczny wzrost (metoda A),
• 1 - materiał jest całkowicie grzybostatyczny (metoda B i B’),
• od 2 do 5 - materiał nie jest odporny na działanie grzybów i zawiera substancje stanowiące pożywkę dla rozwoju mikroorganizmów (metoda A),
• od 2 do 5 - brak efektu zmniejszania się do całkowitego braku efektu grzybostatycznego (metoda B i B’).

Norma ISO 22196: "Pomiar aktywności antybakteryjnej na tworzywach sztucznych i innych powierzchniach nieporowatych"

W badaniach stosuje się 2 szczepy wzorcowe bakterii: Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), znany pod potoczną nazwą gronkowiec złocisty i Escherichia coli (ATCC 8739), czyli pałeczka okrężnicy. Dlaczego stosuje się akurat te 2 szczepy? Ponieważ obydwa uważa się za patogeny towarzyszące człowiekowi i wywołujące najwięcej powszechnych zakażeń.

Czy można stosować inne? Tak, dobiera się je pod kątem docelowego przeznaczenia materiału. Co to oznacza? Jeżeli folia ma mieć zastosowanie w rolnictwie i ogrodnictwie, dobiera się szczepy bakteryjne, które są patogenami roślin uprawnych; jeżeli materiał ma być użyteczny w aplikacjach medycznych, stosuje się wówczas w badaniu patogeny ludzkie.

Właściwości przeciwbakteryjne (oznaczane w międzynarodowej nomenklaturze symbolem R) poszczególnych folii testowych określa się w odniesieniu do próby kontrolnej niezawierającej substancji potencjalnie bakteriobójczej. Zgodnie z normą ISO 22196 uznaje się, że folie wykazują właściwości bakteriobójcze, jeżeli redukcja komórek bakterii zdolnych do wzrostu jest o co najmniej 2 rzędy wielkości większa niż na próbkach kontrolnych.

Metoda badawcza przedstawiona w normie ma na celu zbadanie możliwości i zdolności tworzyw sztucznych do dwojakiego działania mikroorganizmów na materiał polimerowy w czasie 24 godzin. Ten dualizm działania obejmuje: hamowanie (mówimy wówczas o działaniu bakteriostatycznym) lub zabijanie bakterii (wtedy mamy efekt bakteriobójczy).

Metoda jest bardzo czuła, wykrywa bardzo niskie poziomy działania przeciwbakteryjnego przez długi czas i ma charakter ilościowy, a wyniki są powtarzalne.

Podczas prowadzenia analiz liczba poszczególnych mikroorganizmów, a konkretnie ich stężenie, jest standaryzowana. Dzięki temu badacze są w stanie oszacować dokładność poszczególnych testów gwarantując poprawność eksperymentalną. W normie tej określono jasne kryteria i wytyczne dla poziomów biobójczych lub ich braku, przez co nie ma problemów z weryfikacją wyników według międzynarodowych standardów. Aktywność antybakteryjną oblicza się przy użyciu wzoru i wyznacza wartość R w postaci liczb. Jeżeli R>2, wskazuje to na właściwości przeciwbakteryjne.

Podsumowanie

Zarówno norma ISO 22196 jak i ISO 846 mają powszechne zastosowanie dla przetwórstwa materiałów polimerowych i są używane w laboratoriach badających materiały polimerowe pod kątem biologicznym. Dzieje się tak dlatego, że zapotrzebowanie na materiały przeciwbakteryjne jest znaczne.

Używanie materiałów polimerowych zawierających substancje biobójcze stanowi dobry sposób ochrony towaru przed rozwojem niepożądanych mikroorganizmów (bakterii i grzybów). Dzięki nim jest możliwe przedłużenie trwałości wielu różnorodnych produktów oraz poprawienie ich bezpieczeństwa zdrowotnego. Dlatego tak niezmiernie ważne jest prawidłowe określenie właściwości biologicznych takich materiałów. Dzięki normom charakterze międzynarodowym (ISO) można w praktyce przeprowadzać prace naukowo-badawcze oraz komercyjne, które umożliwiają obiektywną, ujednoliconą weryfikację właściwości biobójczych materiałów polimerowych.

Bezwzględnie należy pamiętać, że testy z udziałem mikroorganizmów muszą być wykonywane przez kompetentny i merytorycznie przeszkolony personel, doświadczony w technikach mikrobiologicznych, sterylizacji i dezynfekcji oraz dobrej praktyce laboratoryjnej.

Autor: dr hab. Agnieszka Richert