Badania cytotoksyczności
Kolejnym niezwykle ważnym etapem są badania związane z cytotoksycznym działaniem materiału na komórki biorcy. W tym celu wykorzystywane są odpowiednie linie komórkowe, których główne zalety to stabilność i homogenność. W zależności od wyrobu medycznego bądź przeznaczenia implantu wybierane są konkretne linie komórkowe, takie jak chondrocyty, osteoblasty czy fibroblasty, dzięki czemu badania są niezwykle precyzyjne. Co prawda, badania cytotoksyczności in vitro nie oddają w pełni działania toksycznego in vivo, jednak mogą być doskonałą wskazówką dotyczącą mechanizmu oddziaływania na komórkę. Podstawową normą, która określa warunki i sposób prowadzenia badań jest norma PN-EN ISO 10993-5:2009, Biologiczna ocena wyrobów medycznych - Część 5: Badania cytotoksyczności in vitro. Przewiduje ona trzy testy dla oceny wyrobów medycznych, w zależności od rodzaju materiału i jego przeznaczenia. Są to odpowiednio: testy oparte o bezpośredni kontakt, test dyfuzji w agarze oraz test na wyciągach. W normie określone zostały również warunki przygotowania hodowli do poszczególnych testów, zalecane linie komórkowe, niezbędne ilości próby badanej i kontrolnej oraz warunki ich przygotowania, warunki ekstrakcji, rodzaj materiału, który należy zastosować jako kontrolę pozytywną i negatywną oraz kryteria oceny uzyskanych wyników. Opisane procedury pozwalają na dokonanie jakościowej i ilościowej oceny toksyczności. Przykładowo dla testu na wyciągach ocenia się zmiany morfologiczne komórek wywołane przez substancje wyekstrahowane z badanego materiału w odniesieniu do pięciostopniowej skali:
- stopień 0 - wyrób nietoksyczny (możliwe jest występowanie pojedynczych ziarnistości wewnątrzplazmatycznych)
- stopień I - wyrób słabo toksyczny (pojedyncze komórki rozerwane, około 20% komórek zaokrąglonych, odklejających się)
- stopień II - wyrób umiarkowanie toksyczny (umiarkowana liza komórek, zahamowanie proliferacji w około 50%, około 50% komórek zaokrąglonych)
- stopień III - wyrób średnio toksyczny (zahamowanie proliferacji, zaawansowana liza komórek, około 70% komórek zaokrąglonych, odklejających się)
- stopień IV - wyrób silnie toksyczny (hodowla prawie całkowicie zniszczona).
Podobnie wygląda ocena jakościowa dla testu dyfuzji w agarze i testu bezpośredniego kontaktu. Do oceny ilościowej zalecane jest wykonanie testu z czerwienią obojętną lub jego odmian, bądź testu tworzenia kolonii.
Testy cytotoksyczności przeprowadza się najczęściej z wykorzystaniem płytek 24- lub 96-dołkowych. Komórki są hodowane wraz z badanym materiałem od kilkunastu godzin do kilku dni, a następnie przeprowadza się właściwą ocenę. Pierwszym etapem jest określenie żywotności komórek i typów śmierci komórkowej. Żywotność komórek jest określana za pomocą testów kolorymetrycznych (przykładowo AlamarBlue), testu pinocytozy czerwieni obojętnej (NR) bądź testów, które wykorzystują barwniki fluorescencyjne jak i przeciwciała sprzężone z fluorochromami. Apoptozę komórek można oceniać ilościowo, wykorzystując barwnik PI - jodek propidyny lub 7-AAD w połączeniu z aneksyną V.
Aneksyna V (AnV) jest białkiem o masie cząsteczkowej 32-35 kDa, biorącym udział w przekazywaniu sygnałów i proliferacji komórki, homeostazie wapnia, regulacji transportu pęcherzykowego, jak i w oddziaływaniu z błoną komórkową. Ponadto charakteryzują ją silne właściwości antykoagulacyjne. Jej obecność wykazano w wielu komórkach organizmu - przykładowo w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich naczyń krwionośnych, w limfocytach, makrofagach, na powierzchni erytrocytów czy płytkach krwi. Występuje ona także w komórkach kanalików dystalnych i nabłonku kłębuszków nerkowych. Aneksyna V wykazuje wysokie powinowactwo do fosfatydyloseryny, która pojawia się na zewnętrznej stronie błony komórkowej w trakcie apoptozy.
Najczęściej stosowanym testem oznaczania aktywności cytotoskycznej w warunkach in vitro jest jednak test MTT, oparty na zdolności dehydrogenazy mitochondrialnej (enzymu) do przekształcenia soli tetrazolowej do nierozpuszczalnego formazanu. Kryształy formazanu rozpuszcza się w izopropanolu lub w DMSO, a następnie bada się intensywność zabarwienia w zakresie długości fal 492-570 nm. Jego ilość jest proporcjonalna do aktywności oksydacyjnej mitochondriów komórki, a w ściśle sprecyzowanych warunkach doświadczalnych do liczby żywych komórek w populacji.
Zarówno żywotność, jak i apoptozę można badać również z wykorzystaniem testu luminescencyjnego ViaLight. Test ten polega na bioluminescencyjnym wykrywaniu komórkowego ATP, która stanowi miarę żywotności. Pomiar ATP jest najdokładniejszym, najbardziej skutecznym i bezpośrednim sposobem określania liczby żywych komórek w kulturze. Test można przeprowadzić na różnych luminometrach. Innym sposobem jest wykonanie testu z użyciem odczynnika AlamarBlue, który zawiera przepuszczalny dla komórek, nietoksyczny i słabo fluorescencyjny niebieski barwnik wskazujący resazurynę. W teście następuje ilościowy pomiar proliferacji w komórkach ludzkich, zwierzęcych, bakteryjnych, grzybowych i mykobakteryjnych. Jest użyteczny nie tylko w testach żywotności komórek i oznaczeniach cytotoksyczności in vitro, ale również w testach biologicznych cytokin czy w monitorowaniu wzrostu komórek.
Kolejnym krokiem jest ocena morfologii komórek, której można dokonać z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej, skaningowej, jak i transmisyjnej. Wykorzystuje się również mikroskopię elektronową. W następnych etapach należy oszacować zdolność komórek do przylegania do badanego biomateriału oraz zbadać ich zdolności do proliferacji i aktywności enzymatycznej. Dopiero po przeprowadzeniu tych procedur możliwe jest sformułowanie odpowiedzi, w jakim stopniu badany materiał bądź wyrób medyczny jest toksyczny dla organizmu. Pozytywne wyniki testów umożliwią również podjęcie badań in vivo.
Badania genotoksyczności i rakotwórczości biomateriałów
Współczesne badania rakotwórczości związków chemicznych zazwyczaj opierają się na badaniach epidemiologicznych, które charakteryzują się długim czasem trwania i wysoką ceną. Alternatywę dla nich mogą stanowić testy biologiczne. Badania rakotwórczości przeprowadzane na zwierzętach również są drogie, dyskusyjne pod względem etycznym, ale zajmują zdecydowanie mniej czasu niż badania epidemiologiczne.
W ostatnich latach do przewidywania działania kancerogennego i mutagennego związków chemicznych zaczęto wykorzystywać szybkie testy biologiczne oparte na drobnoustrojach. Zazwyczaj są one stosowane jako testy wstępne. Zgodnie z wytycznymi Organizacji Współpracy Ekonomicznej i Rozwoju (OECD) testy powinny być przeprowadzane dla substancji rozpuszczalnych. W przypadku substancji nierozpuszczalnych powinny zostać przeprowadzone modyfikacje tych metod. Pomimo wielu minusów, metody badania rakotwórczości i genotoksyczności powinny zostać przeprowadzone w przypadku biomateriałów, które mają mieć potencjalne zastosowanie w medycynie regeneracyjnej. Najczęściej należy wykonać kilka testów, ze względu na to że żaden z nich nie jest w stanie wykryć wszystkich typów genotoksyczności.
Jedną z zalecanych metod badania genotoksyczności jest test Amesa, który zgodnie z wytycznymi OECD TG 471, przeprowadzany jest na histydyno-zależnych mutantach Salmonella typhimurium i opiera się na badaniu mutacji powrotnych. Działanie czynnika mutagennego na bakterie może powodować rewersję mutacji, dającą w efekcie przywrócenie funkcjonalnego genu. Formy prototroficzne są zdolne do wzrostu na podłożu niezawierającym histydyny. Do oceny mutagenności mogą być również wykorzystywane szczepy E. coli lacZ-, które syntetyzują nieaktywną formę beta-galoktozydazy.
Inną metodą badania genotoksyczności jest test mutacji genu kinazy tymidynowej na komórkach chłoniaka myszy, który pozwala na ocenę genotoksyczności wielu substancji chemicznych. Mysie komórki nowotworowe są hodowane w środowisku zawierającym czynnik toksyczny. Obecność kinazy tymidynowej pozwala na wbudowywanie tymidyny lub jej analogów do materiału genetycznego. Dodanie do pożywki hodowlanej trójfluorotymidyny (TFT) pozwala wyselekcjonować mutanty komórek, które nabywają zdolności namnażania się w obecności TFT.
Zgodnie z wytycznymi OECD i normy PN-EN ISO 10993-3:2014-12, w celu badania genotoksyczności należy przeprowadzić analizę mikrojąder, które stanowią fragmenty chromosomów. Obecność mikrojąder świadczy o nieprawidłowościach podczas podziału komórkowego. W praktyce test przeprowadza się na liniach komórkowych jajnika chomika chińskiego CHO-K1. Analiza cytogenetyczna komórek poddanych działaniu substancji mutagennych pozwala określić stopień uszkodzeń materiału genetycznego.
